脊髓损伤（Spinal Cord Injury，SCI）是神经系统损伤的一种严重疾病，会导致不可弥补的损害和功能的丧失，并且到目前为止仍然无有效的治疗方法。携带治疗性分子的工程细胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs）有望作为替代SCI疗法，但取决于特定功能化的EVs和适当的工程策略。通过化学修饰的方法将脊髓靶向肽CAQK共轭到细胞外囊泡表面，并将CCL2 siRNA装载进细胞外囊泡，合成一种靶向脊髓损伤区的功能化细胞外囊泡(CAQK-EVs-siRNA)，然后进一步探讨CAQK-EVs-siRNA对SCI的修复作用以及具体机制。

通过超速离心从诱导神经干细胞（Induced neural stem cells, iNSCs）条件培养基中分离出iNSCs衍生的细胞外囊泡。利用生物正交的无铜叠氮炔环加成(点击化学)将功能配体CAQK共轭到细胞外囊泡表面，通过电穿孔技术将CCL2 siRNA装载进细胞外囊泡。使用透射电子显微镜（TEM）、纳米粒子跟踪分析（NTA）和Western blot（使用CD9、CD63、CD81、Alix和TSG101作为细胞外囊泡标记物）对修饰后的EVs（CAQK-EVs-siRNA）进行了鉴定。使用可见光活体成像系统评估CAQK-EVs-siRNA的组织分布。然后，通过建立急性SCI的小鼠实验模型，进行了多项综合评估，包括组织学、成像和功能评估，以研究CAQK-EVs-siRNA在体内和体外的深远影响。重要的是，对包括神经轴突、髓鞘和小胶质细胞极化在内的表型进行了测试，以更详细地阐明CAQK-EVs-siRNA促进运动功能恢复的详细机制。

我们的结果发现CAQK-EVs-siRNA与EVs相比，物理化学特征并没有发生明显变化，且具有较好的生物相容性。体内外的毒性评估实验也表明CAQK-EVs-siRNA治疗耐受性良好，没有明显的全身毒性。重要的是，CAQK-EVs-siRNA尾静脉注射后不仅能够到达脊髓损伤区，而且能靶向作用于活化的星形胶质细胞。SCI小鼠模型的组织损伤和功能评估实验发现CAQK-EVs-siRNA治疗后脊髓明显更完整，病变明显缩小，病理改变明显改善。并且CAQK-EVs-siRNA治疗后SCI小鼠运动功能恢复更明显，具体表现为小鼠BMS评分升高、步态恢复和运动协调能力更好、转棒时间增加、速度增快，肌电图潜伏期变小、波幅升高等。进一步来说，CAQK-EVs-siRNA主要通过影响炎症反应和小胶质细胞极化、减少细胞凋亡来促进神经元的修复，进而促进运动所必需的轴突生成和再髓鞘形成。

我们设计了基于 iNSCs 的工程EVs (CAQK-EVs-siRNA) 以促进 SCI 后运动功能的恢复。CAQK-EVs-siRNA能够将 siRNA 特异性递送至脊髓损伤区并被靶细胞摄取。CAQK-EVs-siRNA利用iNSC衍生的EVs固有的神经修复功能，与负载的siRNA协同作用，增强SCI治疗效果。靶向修饰的EVs与 siRNA的结合有效调节了SCI后微环境的紊乱，改变了小胶质细胞的极化状态，限制了炎症反应和神经元损伤对SCI小鼠运动功能恢复的影响。总之，工程EVs可能是一种可行且高效的治疗SCI有前途策略，这也可能为其他疾病的靶向治疗提供新的见解。