骨骼拥有在骨折后自我愈合的能力，然而并非所有患者都能够有效地实现这种愈合过程。在骨折愈合的过程中，骨膜间充质细胞（MLCs）起着至关重要的作用。然而，这些细胞群体内存在显著的异质性，具备多种不同的亚型，这使得深入研究复杂的修复机制变得更具挑战性。

我们分别从2个月龄的Col2-Cre Rosa-tdTomato（Col2/Td）小鼠的完整胫骨或骨折胫骨的骨痂组织中分离出骨膜，并通过流式分选方法获取了tdTomato阳性（Td+）细胞，以进行单细胞RNA测序。一共构建了3批单细胞文库用于测序，使用了来自骨折前（n=5只小鼠，3只雄性和2只雌性）作为第0天、骨折后第5天（n=6只小鼠，4只雄性和2只雌性）、骨折后第10天（n=6只小鼠，3只雄性和3只雌性）的分选骨膜Td+细胞。我们使用了Seurat软件包、Monocle、scVelo和Slingshot进行数据集的个别或整合分析。

Col2/Td标记了完整骨骼中骨膜的内层，以及骨折后的第5天增厚的骨膜和骨折后第10天愈合组织中的软骨细胞和成骨细胞，但没有标记周围的肌肉细胞。合并的数据集包含了12,298个，并形成7个聚类的骨膜间充质细胞（MLCs）（图1A）：间充质前体细胞（MPCs）、增殖前体细胞（PPCs）、早期软骨细胞（ECHs）、肥大型软骨细胞（HCHs）、成骨前体细胞（OPs）、早期成骨细胞（EOBs）以及成熟成骨细胞/骨细胞（LOB/Ocys）。在第0天，93%的MLCs是MPCs、OPs、EOBs和LOB/Ocys。在第5天的骨膜增厚时，出现了一种新的亚群体PPC（其中73%为增殖细胞）。PPCs高度且特异地表达Acta2、Tagln、Collagen I，并富集了与伤口愈合、应激纤维、收缩性肌动蛋白丝束等GO term，表明它们是肌成纤维细胞。它们还被线粒体相关基因标记，表明代谢活动增加。在第10天的软骨愈合时，出现了软骨细胞亚群。拟时轨迹分析揭示了受伤前后两种不同的分化途径（图1B）。在完整的骨骼中，MPCs通过OPs直接产生OBs和Ocys，指示了骨膜内骨化机制。骨折后，MPCs首先转化为PPCs，然后通过双向分化分化为软骨细胞和OBs/Ocys，表明了软骨内骨化机制。在愈合过程中，由干细胞标志物Cd34、Sca1和Thy1标记的MPCs逐渐减少（分别为第0天、第5天和第10天的54%、35%和7%）。在完整的骨骼中，CD34+/Td+细胞（MPCs）仅占Td+细胞的14%，但却构成了88%的CFU-Fs。在骨折的骨骼（第5天），CD34-/Td+细胞（主要为PPCs）比MPCs多出2.2倍的EdU。qPCR分析确认了CD34+/Td+细胞中干细胞标志物的较高表达以及CD34-/Td+细胞中肌成纤维细胞基因的较高表达。

我们的研究呈现了骨折愈合过程中骨膜间充质细胞（MLCs）的转录组图谱，以及它们对骨折引发的损伤的反应。通过无偏倚、全面覆盖骨膜中整个间充质细胞群体的单细胞RNA测序方法，我们的研究在计算上确定了MPCs作为最原始的前体细胞形式，这些细胞能够在完整和骨折损伤的骨骼中产生其他间充质细胞，并主导骨折愈合。此外，我们揭示了一个以前未被发现的亚群体，其表现出肌成纤维细胞特征，并在愈合过程中对于骨痂的形成起着重要的作用。