研究目的：

高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent Klebsiella pneumoniae, hvKP)是不同于经典肺炎克雷伯菌（classical Klebsiella pneumoniae, cKP）的病原体分型，其与cKP相比具有更强的致病力。更为严峻的情况是，近年由于可移动基因元件的存在，有关兼具高毒力和高耐药性的多重耐药高毒力肺炎克雷伯菌（multidrug-resistant hvKP, MDR-hvKP）的报道不断攀升，这种新型超级细菌对人类健康构成了巨大威胁。QseBC双组份系统（two-component system, TCS）与细菌群体感应有关，其在大肠杆菌中具有调节生物膜形成、动力和毒力的作用，但是QseBC在hvKP中的功能未见报道，故我们旨在探究QseBC在hvKP菌株ATCC43816中所发挥的作用，以期为hvKP的预防、诊断和治疗提供新思路。

研究方法：

本研究运用CRISPR-Cas9系统构建缺陷株ATCC43816ΔqseB/ΔqseC/ΔqseBC，并利用pBAD24构建敲除基因的回补质粒。后续我们对野生株、缺失株以及回补株进行了生物学特性研究，主要包括生长曲线实验、药敏实验、拉丝实验、黏度半定量实验、糖醛酸定量实验、生物膜形成实验、血清杀伤实验和大蜡螟毒力实验。为进一步探讨QseBC在hvKP中的调控机制，我们利用比较转录组学对野生株和敲除株进行了差异基因比较，并通过实时荧光定量PCR验证基因的表达量是否与转录组结果趋势一致。

研究结果：

1.将含有靶基因N20的质粒pSGKP-QseB/QseC-N20和相应靶基因的同源臂电转至表达Cas9蛋白的ATCC43816中，从安普霉素/利福平双抗平板上挑选菌落进行PCR验证后得到ΔqseB、ΔqseC、ΔqseBC。将qseC基因克隆至表达质粒pBAD24构建重组质粒pBAD24-qseC，随后将该质粒电转至ATCC43816ΔqseC中构成回补株ATCC43816ΔqseC-pCqseC。

2.qseB、qseC、qseBC基因缺失株的生长速率、菌落形态、抗生素药物敏感性、黏度及荚膜含量与野生株ATCC43816相比无明显差异。生物膜形成实验结果显示，qseC基因缺失株生物膜形成量增加，而回补株ATCC43816ΔqseC-pCqseC的生物膜形成能力与ATCC43816ΔqseC-pBAD24相比明显减弱。血清杀伤实验结果显示，野生株和缺失株均呈现血清抵抗，qseC基因缺失增加了血清抵抗能力，而回补株ATCC43816ΔqseC-pCqseC在一定程度上增加了ΔqseC对血清杀伤的敏感性。蜡螟杀伤实验显示qseC基因缺失株增强了对蜡螟的致死力，而回补株ATCC43816ΔqseC-pCqseC降低了蜡螟感染的死亡率。

3.RNA-seq分析显示，ΔqseC中共有216个差异表达基因，其中下调基因30个，上调基因186个，其中与生物膜形成相关的基因（glgC, glgP, glgA, gcvA, bcsA, ydaM, paaF, ptsG）、细菌Ⅵ型分泌系统（virB4, virB6, virB10, vgrG, hcp）、铁载体生物合成（entC, entD, entE）与ATCC43816相比显著上调。此外，qseB、ygiW和AraC家族转录调节因子IT767_23090基因在qseC缺失株中的表达量显著上升。

研究结论：

1.本研究通过CRISPR-Cas9成功构建了高毒力肺炎克雷伯菌ATCC43816 qseB、qseC、qseBC基因缺失株，并且利用质粒pBAD24完成了qseC基因的回补，为进一步的研究奠定了基础。

2.本研究发现，高毒力肺炎克雷伯菌ATCC43816的qseC基因缺失增强了其菌株毒力、血清抵抗能力以及生物膜形成能力，而qseB、qseBC基因的缺失并未产生以上影响。

3.转录组结果显示，ΔqseC中IT767_23090、ygiW、qseB三个基因表达显著上调。qseC基因的缺失所致的毒力及生物膜形成能力增加与毒力相关基因和生物膜形成相关基因的表达上调一致，而这些基因的上调可能与IT767_23090、ygiW、qseB的基因上调相关。