血小板输注无效是一种血小板免疫疾病，是指随机供体输注血小板反复失败，并与出血风险增加、存活率降低和住院时间延长等有关。常见的血小板输注无效病例是由免疫因素介导的，例如针对人类白细胞抗原（HLA）的同种抗体，以及人类血小板抗原（HPA）的同种抗体。目前临床上对于HLA抗体相容检测较多，但对于HPA抗体表达情况的研究较少。HPA位于人血小板膜糖蛋白，HPA-15系统于1990年被发现，并被命名为Gov同种抗原系统，由Gov a和Gov b两个等位基因组成。HPA-15 属于双等位共显性遗传系统，同种异体抗原决定簇位于单体糖蛋白CD109 上，编码HPA-15a和15b抗原的等位基因是由CD109 cDNA 编码区2108位A→C单核苷酸取代而产生的，导致CD109蛋白第682位酪氨酸由丝氨酸代替。

    在临床上，对于HPA的检测，主要是血清学和基因分型两大类技术。血清学方面，主要有单克隆抗体特异性捕获血小板抗原（MAIPA）技术，是ISBT推荐的检测HPA抗体的金标准，具有较高的灵敏度和特异性。除此以外还有改良抗原捕获酶联免疫吸附实验（MACE）、固相红细胞粘附技术（SPRCA）以及血小板免疫荧光技术（PIFT）。相较于血清学方法需要一定数量的血小板和特异性抗体，以PCR技术为基础发展起来的基因突变分析技术突破了血清学方法的诸多局限，那就是序列特异性引物聚合酶链式反应（PCR-SSP），其方法简单快速，也广泛应用于临床。此外，之前有一些研究人员在血小板输注无效患者中检测到HPA-15抗体。然而，关于输血供者与受者HPA-15是否相容对血小板输注效果的相关研究，还较为局限。其原因主要还是，由于血小板表面CD109表达较低，可以检测HPA-15抗原抗体的实验室数量有限，对检测技术要求较高。有国外研究报道，抗HPA-15抗体检测OD值与HPA-15抗原表达水平密切相关。因此研究HPA-15抗原表达量的高低，对检测HPA-15同种抗体也尤为重要。

    本研究以苏州地区的无血缘相关献血者为研究个体，使用序列特异性引物聚合酶链式反（PCR-SSP）检测个体的HPA-15等位基因分布频率；对苏州地区100名无血缘关系献血者的HPA-15系统进行基因分型，计算基因型频率和基因频率。

    研究方法：通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性进行基因分型。

（1）使用DNA纯化试剂盒从EDTA抗凝血中提取DNA；

（2）将5µL基因组DNA的模板添加到含有10 mmol/L Tris、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、0.125 mmol/L dNTPs、各0.5 µmol/L引物、以及2.5个单位的DNA聚合酶的反应体系中； 

（3）在96℃预变性10分钟后，在热循环仪中进行30个循环，包括变性（96℃，25s），退火（54℃，45s）和延伸（72℃，30s）；

（4）吸取7µL的PCR产物用核酸内切酶在60℃下消化90分钟，限制性片段通过3%琼脂糖凝胶电泳分析； 

（5）根据电泳谱带的有无判定等位基因型别；

（6）统计学处理：基因型分布的期望值与观察值以及不同人群基因频率分布采用x2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

     研究目的：

（1）对无偿献血人群中HPA-15基因分型进行相应的研究调查。

（2）后续可通过对无偿献血人群HPA-15抗原抗体检测，评估血小板输注疗效，尽最大可能规避输血相关风险。