陆锴1,2 , 林赠华1 , 任海鹃1,2 , 张志鹏1,2 , 李玟1,2
1. 南通大学附属医院
2. 南通大学
目的:探讨芦可替尼联合G-MDSC在再生障碍贫血(AA)小鼠中的治疗作用。
方法:(1)通过腹腔输注C57/B6小鼠淋巴结细胞至TBI后的B6D2F1小鼠体内建立AA小鼠模型。(2)使用Easy Sep磁珠从C57/B6小鼠骨髓中分离出G-MDSC;16只AA小鼠分为对照组、喂药组、细胞组、联用组,对照组尾静脉输注0.2ml PBS联合灌胃DD水;喂药组尾静脉输注0.2mlPBS联合灌胃给药60mg/kg 芦可替尼;细胞组尾静脉输注浓缩在0.2mlPBS中的1.2×107个G-MDSC联合灌胃DD水;联用组尾静脉输注浓缩在0.2mlPBS中的1.2×107个G-MDSC联合灌胃给药60mg/kg 芦可替尼;第12天处死小鼠并收集小鼠外周血行血常规检测;收集骨髓、脾脏有核细胞行流式细胞术检测小鼠T淋巴细胞亚群变化,收集小鼠胸骨行活检病理HE染色观察骨髓造血情况。(3)收集C57/B6小鼠骨髓细胞进行裂红处理以获得骨髓有核细胞,分为DMSO组、RUX组,DMSO组加入GM-CSF(10ng/ml)、DMSO(10μM);RUX组加入GM-CSF(10ng/ml)、芦可替尼(5μM/10μM);5天后收集培养所获得细胞行流式细胞术检测G-MDSC变化。
结果:(1)与正常小鼠相比,模型小鼠出现了明显的三系减少。(2)喂药组小鼠较对照组小鼠的WBC、HB、RBC均明显提高(P<0.01)、PLT显著上升(P<0.0001)。细胞组小鼠相较对照组小鼠的WBC、HB、RBC、PLT均明显提高(P<0.05)。联用组小鼠较对照组小鼠仅有WBC上升(P<0.001),且较药物组出现HB、PLT的下降(P<0.05),RBC下降明显(P<0.001)。(3)在骨髓的流式细胞术检测中,对照组、喂药组、细胞组、联用组CD3+CD8+T淋巴细胞比例分别为(63.60±6.55)%、(43.12±11.31)%、(48.10±7.67)%、(51.25±7.93)%,药物组、细胞组相较对照组有显著下降,联用组有明显下降。CD3+CD4+T淋巴细胞比例分别为(27.50±4.84)%、(43.12±13.31)%、(35.87±7.93)%、(35.88±4.46)%,实验组均较对照组有上升,CD4+T/CD8+T细胞比值相较对照组均增高。(4)在脾脏的流式检测中,相较于对照组,CD3+CD8+T淋巴细胞均有下降,CD3+CD4+T淋巴细胞变化均无统计学意义,仅有联用组CD4+T/CD8+T比值上升,药物组、细胞组比值无统计学意义。(5)在小鼠的一般表现上,联用组小鼠较其他组明显活跃。体重变化上,实验组均不变或略微下降,对照组小鼠体重明显降低。在胸骨切片检查中,对照组出现大量空泡,造血细胞明显降低,实验组空泡少见,骨髓密度较高。(6)在培养所获得的细胞中行流式细胞术检测,DMSO (10μM) 组、RUX (5μM)组、RUX (10μM)组CD45 ly6G CD11b比例分别为(50.40±2.29)%、(53.27±1.24)%、(45.53±3.28)%,5μM的RUX提高了G-MDSC含量(P<0.05)、10μM的RUX降低了G-MDSC含量(P<0.05)。
讨论:我们发现联用组相较于药物组、细胞组对再障小鼠血常规的改变并不明显,但有着更好的流式细胞术检查结果;在药物对细胞的作用研究中,低浓度的芦可替尼可以促进C57/B6小鼠的G-MDSC的增生,而较高浓度则会抑制。有研究表明清除小鼠体内G-MDSC会加重小鼠再障情况,我们推测不同的对照因素会对再障小鼠骨髓内G-MDSC产生影响,需要进一步研究来明确芦可替尼联合G-MDSC在再障小鼠中的治疗作用。